Temeljna elektroforeza, tehnika, za kaj je, primeri

The Elektroforeza Gre za tehniko, ki se uporablja za ločevanje molekul v električnem polju. Natančneje mora narediti selitev delcev, naloženih pod vplivom električnega toka, ki se uporablja med dvema pologoma, enim pozitivnim in drugim negativnim.

Elektroforeza je trenutno eden najbolj rutinskih postopkov, ki potekajo med razvojem poskusa, zlasti na področjih, povezanih z analitično kemijo, biokemijo ter biološkimi in medicinskimi znanostmi na splošno.

Vedro elektroforeze. Vir: Melodygar/CC by-SA (https: // createCommons.Org/licence/by-sa/4.0

Uporablja se za ločevanje beljakovin, peptidov, DNK, RNA in drugih glede na njihovo obremenitev, velikost, gostoto in čistost.

Različne poslovne hiše so zasnovale različne formate z različnimi aplikacijami in ustreznimi dobički za posebne namene, vendar vsi postopki zahtevajo enake osnovne elemente:

- Vir energije za ustvarjanje električnega naboja

- Medij podpore za ločitev

- Varovalna raztopina (pufer) Ohraniti konstantno pH

[TOC]

Osnova

Elektroforeza ni nič drugega kot migracija (ločitev) delcev ali naloženih molekul (naravno ali umetno) v mediju ali podpori pod vplivom električnega polja.

Tehnika temelji na eni od glavnih fizičnih enačb elektromagnetizma, po katerih je sila enaka električnemu naboju, pomnoženem z električnim poljem, uporabljenim v tej točki (F (sila) = q (električni naboj) x e (električno polje ).

V skladu s to enačbo se bosta dva delca z isto maso, vendar različnih obremenitev, v istem električnem polju premaknila na različne stopnje. Poleg tega bo hitrost gibanja teh delcev odvisna od razmerja med njihovo obremenitvijo in maso.

Znanstveniki so izkoristili te lastnosti in tovorni/masni odnosi, da so komponente ločili od biomolekul v svojih najmanjših delih, pa tudi, da ločijo različne molekule v mešanici, med drugim.

Pomembno si je zapomniti, da imajo biološke molekule, kot so aminokisline, peptidi, beljakovine, nekateri ogljikovi hidrati, nukleotidi in nukleinske kisline.

Tehnika

Čeprav obstajajo različne vrste elektroforeze, je gel elektroforeza najbolj uporabljena pri biokemični analizi, molekularni biologiji in biotehnologiji, zato bomo na kratko govorili o tem, o čemer bomo na kratko govorili.

Kot že ime pove, gel elektroforeza pomeni uporabo trdnega trdnega nosilca, bodisi za analizo/ločevanje zmesi beljakovin ali nukleinskih kislin (DNK in/ali RNA) pod vplivom električnega polja.

Sistem ali aparat, ki se uporablja za izvajanje elektroforetskega "teka", je lahko vodoravni (običajno se uporablja za nukleinske kisline) ali navpične (običajno se uporablja za beljakovine).

- Primer tehnike elektroforeze nukleinske kisline

Nukleinske kisline običajno ločimo z agaroznimi geli (galaktozni polisaharid), ki jih pripravimo z ustrezno puferno raztopino (Tris/acetat/EDTA ali Tris/Borato/EDTA) in katerih koncentracija bo določila "ločljivost" fragmentov različnih velikosti.

Vam lahko postreže: Zemljina prehranska veriga: povezave in primer

Priprava vzorca

Prvi korak pred izvedbo elektroforetskega teka v agaroznem gelu je pridobitev vzorca. To bo odvisno od eksperimentalnega konca in vzorci so lahko produkt encimske prebave, od verižne reakcije polimeraze (PCR), čiščenja nukleinskih kislin itd.

Mešana vzorca z nalaganjem obremenitve.Org/licence/by/4.0) prek Wikimedia Commons)

Po pridobitvi to mešamo z barvno raztopino (raztopina obremenitve), ki omogoča hitro odlaganje vzorca v vdolbinici, saj ima glicerol in barvilo, ki vizualno omogoča tek.

Priprava gela

Ta korak je sestavljen iz mešanja potrebne količine geling substrata (agaroze) z pufersko raztopino, ga taljenje s toploto in strjevanjem na podpori, ki deluje kot "plesen".

Med gelifikacijo se v gel vnesejo nekateri "glavniki", nameščen v "kalupu", da se odloži "vrtine", kjer bodo vzorci predstavljeni pred vožnjo.

Ko se gel ohladi in utrdi, se "glavniki" odstranijo in ga vnesejo v posodo, znano kot "vedro", ki je polna raztopine tekaške pufre (TRIS/Acetate/EDTA ali Tris/Borato/Borato/EDTA).

To vedro je vključeno v tisto, kar se imenuje "elektroforetska komora", kar ni nič drugega kot vsebnik, skozi katero je prešlo električno polje in ima prostor, kjer je vstavljen gel, in dva odseka, s katerimi sta napolnjena raztopina pufer (pufer teči).

Ta kamera ima dve elektrodi, eno pozitivno in eno negativno, med katerimi se ionsko gibanje proizvede po nanosu električnega polja (povezan je z virom energije).

Nalaganje vzorcev

Ko se vzorci pomešajo z ustrezno raztopino obremenitve, se ti vnesejo v "vrtine", ki so bile prej narejene v gel.

Ker imajo nukleinske kisline negativno neto obremenitev, se migrirajo iz negativnega pola v pozitivno, zato je treba to upoštevati, ko je kamera povezana z virom napajanja kjer so bili naloženi vzorci.

Čas Corrida je vzpostavljen v strogi odvisnosti od raziskovalca, zadolženega za poskus. Napetost se običajno izračuna v 5 -voltnem razmerju na centimeter v gelu, ki ločuje obe elektrodi.

Prikaz

Ko gel teče (ko so vzorci potovali z gelom z enega konca do drugega), je potopljen v raztopino etidnega bromida (ETBR), barvilo, ki je prepleteno med dušikovimi podlagami in "blagovno znamko" lahko jih vizualiziramo v predilumenatu z ultravijolično svetlobo.

Kaj je elektroforeza za?

Elektroforeza se je v preteklosti uporabljala z več namenami. Danes pa je njegova uporabnost v veliki meri odvisna od "vprašanja", ki ga raziskovalec zastavi v zvezi s pojavom ali določenim sistemom, pa tudi na vrsto elektroforeze, ki jo želi uporabiti.

Vam lahko služi: topoisomeraza: kaj so, značilnosti, funkcije, vrste

Lahko pa vključimo nekatere glavne funkcije, ki jih ima ta tehnika, začenši z najbolj "redkimi" in se konča z najbolj priljubljenim in večinoma izkoriščanjem v svetu bioloških znanosti. Elektroforeza je koristna:

- Za kvantitativno analizo kompleksnih mešanic makromolekul in za izračun potencialne "zeta" (koloidna lastnost delca v tekočem mediju pod vplivom statičnega električnega polja).

- Za analizo krvne serume za diagnostične namene.

- Za ločitev glukoproteinov, lipoproteinov in krvnega hemoglobina.

- Za analizo hrane, farmacevtski izdelki in onesnaževala okolja.

Elektroforeza v agaroznih gelih

- Za ločitev fragmentov DNK po prebavi z restrikcijskimi encimi.

- Za ločitev molekul nukleinske kisline pred prenosom na membrane za nadaljnje analize.

- Za analizo PCR produktov (verižna reakcija polimeraze), ki preverjajo, ali se je pojavila.

- Za oceno velikosti molekul v mešanici DNK ali RNA.

- Za oceno količine in/ali kakovosti prečiščenih nukleinskih kislin.

Elektroforeza v poliakrilamidnih gelih pod denaturalizacijo ali domačimi pogoji

- Za določitev velikosti beljakovin.

- Za identifikacijo beljakovin.

- Za določitev čistosti vzorca po več korakih čiščenja.

- Prepoznati prisotnost intramolekularnih disulfidnih povezav.

- Za določitev interakcije med beljakovinami.

- Za določitev izoelektrične točke beljakovin.

Fotografija akrilamidnega gela po poteku več vzorcev beljakovin (vir: Larionova.Marina/CC BY-SA (https: // creativeCommons.Org/licence/by-sa/4.0) prek Wikimedia Commons)

Dejavniki, ki vplivajo na elektroforezo

Migracija delca v električnem polju je odvisna od različnih dejavnikov, med katerimi so:

- Vaš električni naboj

- Njegova molekularna velikost

- Njegova hidrofobnost in obliko

- Velikost električnega polja, ki se uporablja

- Uporabljena temperatura sistema in ionska sila puferne raztopine

- Narava okolja, kjer se nahaja

V zvezi z vzorcem

Med parametri, povezanimi z delci (vzorec), ki so podvrženi električnemu polju, so glavni dejavniki, ki vplivajo na ta postopek, povezani z njihovo obremenitvijo, njihovo velikostjo in obliko.

Večja kot je neto obremenitev delca, večja je njegova migracijska hitrost in ta velikost bo odvisna od pH. Vendar je odnos z velikostjo obratno sorazmerno, kar pomeni, da bolj "velika" molekula, počasneje se migrira.

Lahko vam služi: lia agar (železni lizin): kaj je, temelj, priprava, uporaba

V zvezi z električnim poljem

Do zdaj smo govorili o pomenu električnega polja za doseganje gibanja delca z elektroforezo, vendar nismo opredelili, kaj je: električna sila na enoto obremenitve ali, poenostavljeno, območje prostora, kjer je tam električna sila.

Parametri v zvezi z električnim poljem, ki lahko vpliva na migracijo, so napetost, tok in upornost.

Napetost vpliva na "čas letenja" molekul, ki so ločene po nanosu električnega polja. Višji je, hitrejši so te premike.

Tok (neprekinjeni in enakomerni elektroni, ki jih "potisne" napetostni vir), se izvaja med elektroforetskimi elektrodami zahvaljujoč ionom, ki so prisotni v puferski raztopini. Je neposredno povezan z napetostjo.

V zvezi s puferskim raztopino

Sestava, ionska sila in pH puferske raztopine so glavni parametri, ki vplivajo na elektroforetski "tek", saj neposredno vplivajo na nekatere lastnosti vzorcev, zlasti na električni naboj.

Ker? Puferska raztopina stabilizira pH podpornega medija, kjer se pojavi elektroforeza. Njegova sestava lahko vpliva na premik migracijskih delcev in tudi ionsko koncentracijo, saj je neposredno povezana s tokom.

V zvezi s podpornim medijem

Različne vrste in formati elektroforeze predstavljajo tudi različne medije, na katerih se pojavlja migracija in kjer se lahko pozneje "registrira".

Stopnja migracije molekul, ki so podvržene elektroforezi.

Njegove absorpcijske značilnosti, elektroendoozmoza so pomembne (gibalna sposobnost tekočine skozi membrano pod vplivom električnega polja) in zmogljivost molekulske site.

Primeri uporabe elektroforeze

Klasični primeri elektroforetskih tehnik, ki se uporabljajo v biologiji in biotehnologiji, vključujejo:

- Elektroforeza v agaroznih gelih (angleščina Gel elektroforeze)

- Elektroforeza v akrilamidnih gelih v denaturalizacijskih pogojih (SDS-PAGE, angleščina Natrijev dodecil sulfat poliakrilamidni gel elektroforeza)

- Elektroforeza v akrilamidnih gelih v domačih pogojih (BN-PAGE, angleščina Modra domača poliakrilamidna gel elektroforeza)

- Elektroforeza v dveh dimenzijah (2D-strani iz angleščine Dvodimenzionalna elektroforeza poliakrilamidnega gela)

- Kapilarna elektroforeza (iz angleščine Kapilarna elektroforeza)

- Isolectroenfoque (angleščina Izolektrofokuziranje)

- Elektroforeza impulza polja (angleščina Elektroforeza impulza polja)

Reference

1. Beck, Kevin. (2020, 25. maja). Vrste elektroforeze. Znanstvenik.com. Pridobljeno iz znanosti.com
2. Eseji, Velika Britanija. (November 2018). Vrste in aplikacije elektroforeze. Pridobljeno iz ukessays.com
3. Nelson, d. L., Lehninger, a. L., & Cox, m. M. (2008). Lehningerjeva načela biokemije. Macmillan.
4. Parmar, str. (Avgust 2018). Elektroforeza: pomen, definicija in razvrstitev (z diagramom). Bio tehnologija. Pridobljeno iz biotehnologije.com
5. Perrett, d. (2010). 200 let elektroforeze. Kromatog. Danes, 4-7.
6. RIGHETTI, str. G. (2005). Elektroforeza: pohod penijev, pohod Dimesa. Časopis za kromatografijo A, 1079 (1-2), 24-40.
7. Rilbe, h. (devetnajst devetdeset pet). Som spominja na zgodovino elektroforeze. Elektroforeza, 16 (1), 1354-1359.
8. Vesterberg, ali. (1993). Kratka anamneza elektroforetskih metod. Elektroforeza, 14 (1), 1243-1249.
9. Vinayagam, m. (Ni datuma). Dejavniki, ki vplivajo na elektroforezo. Akademija.Edu. Pridobljeno iz akademije.Edu