Gramovo obarvanje

Gramovo obarvanje je koristno za vizualizacijo različnih vrst bakterij

Kaj je Gramovo obarvanje?

The Gramovo obarvanje V diagnostični mikrobiologiji je najpreprostejša in najbolj uporabna tehnika barvanja za prepoznavanje bakterij. To tehniko je ustvaril danski zdravnik Christian Gram leta 1884, ki je bakterije razvrstil v gram -pozitivno (vijolično) in gram -negativno (roza), v skladu s sestavo celične stene.

Tehnika je leta 1921 doživela določene spremembe Huckerja za stabilizacijo reagentov in izboljšanje kakovosti obarvanja, zato je Gramovo obarvanje znano tudi kot Gram-Hucker.

S to tehniko je tudi mogoče. Kot tudi njegova porazdelitev v vesolju: v grozdu, v verigi, izolirani, v parih, v tetradah itd.

Osnova

To je tehnika, ki predstavlja 4 temeljne korake: obarvanje, pritrditev z mordanom, razbarvanje in najem. Zato vam poleg barvnih bakterij omogoča tudi njihovo razlikovanje.

Violet Crystal je prvo uporabljeno barvilo. Enako ima afiniteto do peptidoglikana in bo barvilo vse prisotne bakterije, nato postavilo lugol, ki deluje kot mordant, to je, da bo sprožila tvorbo netopnih kompleksov vijoličnega stekla/joda/ribonuklearne beljakovine znotraj celice.

Gram -pozitivne bakterije, ki imajo debelo peptidoglikansko steno, tvorijo bolj zapleteno (vijolično/jodno steklo), zato bodo barvane vijolične.

Prav tako vpliva, da stena gram -pozitivnih bakterij vsebuje več neželenih kislin, ki kažejo veliko afiniteto za oksidacijska sredstva (Lugol).

Gram -negativne bakterije imajo tanko ogrinjalo peptidoglikana, zaradi česar so bakterije manj zapletene kot gram -pozitivno.

Nato pride korak razbarvanja, kjer se gram -pozitivne in gram -negativne bakterije obnašajo drugače.

Gram -negativne bakterije vsebujejo zunanjo membrano, bogato z lipopolisaharidi, ki je del njegove celične stene. Maščobe se uničijo s stikom z acetonskim alkoholom, zato je zunanja membrana destabilizirana, vijolično steklo pa se sprosti.

Tako ga pozneje najamejo z osnovnim safraninom ali fuchsinom, pri čemer jemlje rdečo barvo.

V primeru gram -pozitivnih bakterij se upirajo razbarvanju, ker belilo deluje tako, da zapre pore, kar preprečuje, da bi se vijolični kristalni kompleks/jod lahko izvlekel.

Zato je obarvanost z vijoličnim steklom stabilna in za safranin ali fuchsin ni prostora. Zato so te bakterije barvane intenzivne ali vijolične.

Materiali

Gramov barvni komplet je sestavljen iz:

- Vijolično steklo.

- Lugol.

- Acetonski alkohol.

- Osnovni safranin ali fuchsin.

Priprava barvil in reagentov

Vijolična kristalna raztopina

Rešitev za:

Violet Crystal - 2 gr

95% - 20 ccm etilnega alkohola

Rešitev B:

Amonijev oksalat - 0.8 gr

Destilirana voda- 80 ccm

Za končno pripravo vijoličnega stekla je treba raztopino do 1:10 razredčiti z destilirano vodo in zmešati s 4 deli raztopine B. Mešanica se shrani 24 ur, preden jo uporablja. Filtrira se v steklenico za obarvanje jantarja s papirnatim filtrom.

Lahko vam služi: chiapas flora in favna: reprezentativna vrsta

Količina, ki se uporablja vsak dan, se premakne v jantarno steklenico z kapalko.

Jod-lugol

Tehta in izmeri navedeno količino vsake spojine, kot sledi:

Jodni kristali - 1 gr

Kalijev joduro - 2 gr

Destilirana voda - 300 ccm

Kalijev jodid se malo po malo raztopi v vodi, nato pa jod dodamo. Rešitev za jantarno steklenico se prenese.

Količina, ki se uporablja na dan, se premakne v manjšo jantarno steklenico z kapalko.

Zastoje

95% etilni alkohol - 50 ml

Aceton - 50 ml

Pripravljen je v enakih delih. Dobro pokrije, ker ponavadi izhlapi.

Bottero v ft.

Ta priprava zagotavlja zmerno razbarvanje časa 5-10 sek., In je najbolj priporočljivo.

Beginters raje uporablja le 95%etilnega alkohola, kjer je razbarvanje počasnejše, od 10 do 30 sek.

Medtem ko lahko najbolj izkušeni uporablja čisti aceton, kjer se razbarvanje zelo hitro pojavi od 1 do 5 sek.

Kontrast

Safraninska matična rešitev

Safranin - 2.5 gr

95%etilni alkohol - 100 ccm

Po tehtanju navedene količine safranina se raztopi pri 100 ccm etilnega alkohola pri 95%.

Iz matične raztopine pripravimo delovno raztopino safranina.

Če želite to narediti, izmerite 10 ccm matične raztopine, dodajte 90 ccm destilirane vode, da dokončate 100 ml.

Priporočljivo je, da se znesek, uporabljeno vsak dan, prenese v jantarno steklenico s kapljico.

Mikroorganizmi, ki jih šibko barvamo z obarvanjem Gram-Huckerja, kot določene anaerobe, Legionella SP, Campylobacter SP in Brucella sp, Lahko jih obarvamo veliko bolje, če je sprememba, ki jo je Kopeloff spremenil na obarvanje Gram-Huckerja, imenovano gram-kopeloff obarvanje.

Ta tehnika spreminja safraninsko barvilo za osnovni fuchsin. S to spremembo je mogoče učinkovito obarvati prej omenjene mikroorganizme.

Shranjevanje reagentov

Pripravljena barvila morajo biti shranjena pri sobni temperaturi.

Priprava razširjenega vzorca na barvanje

Vzorec mora vsebovati vsaj 10⁵ mikroorganizmi pred njegovim opazovanjem so verjetno v razmazu. Iztegnjene lahko izvedemo iz neposrednega vzorca ali pridelkov v trdnih ali tekočih medijih.

Razširjeni morajo biti enotni, dobro razporejeni in ne zelo debeli za boljšo vizualizacijo prisotnih struktur.

Gram neposrednih vzorcev

Gram urina brez centrifugiranja

Urin mešamo in 10 ul postavimo na diapozitiv. Opazovanje vsaj enega bakterije/potopnega polja kaže, da obstaja okužba.

To pomeni, da bo imel pridelek približno več kot 100.000 UFC/ML (10⁵ UFC/ml) urina v 85% primerov.

Ta metoda ni uporabna za kolonialne štetje pod 100.000 UFC.

Gram CSF

CSF mora biti centrifuga, supernatant se odstrani in usedlina se razprostira na diapozitivu. Ta tekočina je sterilna v normalnih pogojih. Opazovanje bakterij kaže na okužbo.

Vam lahko postreže: solne žleze

Gram dihalnih vzorcev

Sputum gram, bronhialno ali bronkoalveolarno pranje, čeprav lahko obstajajo različni mikroorganizmi, bo vedno vodila diagnozo, poleg tega pa bo koristna vrsta opažene celice.

V primeru Esputo je treba pripraviti razširjeni z najbolj gnojnimi deli vzorca.

FECES GRAM

Tovrstne vzorce ni priporočljivo narediti Gram, saj nima diagnostične vrednosti.

Gram pridelkov

Naredite jih lahko na dva načina, enega iz tekočih pridelkov in drugega iz trdnih pridelkov.

Tekoči pridelki

Iz tekočih pridelkov je izjemno preprosto: pod vžigalnikom se odvzame več pražencev muzečega juha in postavite na čist in suh diapozitiv, kar daje krožne gibe od središča na obrobje, da se material enakomerno porazdeli.

Dovoljeno mu je spontano. Ko se posuši, je material pritrjen na list s toploto. Če želite to narediti, s pomočjo sponke prestavite listo 3 do 4 -krat skozi plamen vžigalnika.

List se pusti, da se ohladi in postavi na obarvani most.

Trdne pridelke

Za izvedbo podaljšanega grama obarvanja iz trdnega pridelka nadaljujte tako, kot sledi:

Preden izberete kolonije, ki jih je treba vzeti, morate pripraviti režo, tako da namestite približno dve kapljici sterilne fiziološke fiziološke raztopine.

Če originalna plošča za gojenje vsebuje več vrst različnih kolonij, bo za izvedbo grama izbrana izolirana kolonija vsake. Vsaka kolonija bo vzeta s platinasto ročajem, da jo raztopimo v fiziološki raztopini, ki je bila prej postavljena na diapozitiv.

Krožni gibi so podani od središča do obrobja, da homogeno porazdelijo kolonijo v diapozitivu.

Dovoljeno mu je spontano. Ko se suha, je list pritrjen s toploto, kot je razloženo zgoraj (plamen reže z vžigalnikom), pri čemer pazite.

Ta postopek je treba izvesti z vsako različno vrsto kolonije. Na primer vrstni red opaženega:

Colonia 1: Betahemolitična rumena kolonija: Gram -pozitivni kokosi so opazili v grozdih.

Colonia 2: Cream Colonia, brez hemolize: opazili so gramnegativni kokobacili.

Vsak list mora biti označen, da vemo, kaj opažamo.

Tehnika

Gramova tehnika obarvanja je izjemno preprosta za izvajanje in razmeroma ekonomsko in je v laboratoriju za mikrobiologijo manjka.

To je narejeno na naslednji način:

1. Razmaz nastavite s toploto in postavite na barvni most.
2. List je za 1 minuto popolnoma prekrit z vijoličnim steklom.
3. Operite z vodo. Ne posušite.
4. List pokrijte z raztopino Lugol, naj deluje 1 minuto. Operite z vodo. Ne posušite.
5. Okrasite 5-10 sekund z mehko vznemirjenostjo v acetonskem alkoholu. O Postavite list navpično in spustite kapljice za razgradnjo na površino, dokler ne vleče rezerv vijoličnega kristala. Ne presegajte.
6. Operite z vodo. Ne posušite.
7. List postavite na obarvani most in pokrijte 30 sekund s safraninom (Gram-Hucker) ali 1 min z osnovno fuchsino (Gram-Kopeloff).
8. Operite z vodo.
9. Izpustite spontano v zraku v navpičnem položaju.

Lahko vam služi: flora in favna

Ko se posušite, postavite 1 kapljico potopnega olja, da ga opazujete pod tarčo 100x v optičnem mikroskopu.

Uporaba/aplikacije obarvanja z gramom

- Ta tehnika omogoča razlikovanje morfotintorialnih razlik večine bakterij.

- Kvarte se razlikujejo tudi s to obarvanostjo. Vzamejo vijolično steklo, to je barvano gram -pozitivno.

- Lahko ločite gram -pozitivne spore bacile, kjer se znotraj bacila opazi jasen prostor, kjer je nastala endospora, čeprav spore niso dobro obarvane. Za barvanje spore se uporabljajo druge tehnike, na primer Shaeffer-Fulton.

- Pomaga določiti vrsto antibiotika, ki ga je treba pripraviti.

Treba je opozoriti, da to obarvanje Ne deluje Za barvanje vseh vrst bakterij, to je primeri, v katerih obarvanje ne deluje.

V teh primerih je mogoče omeniti bakterije, ki nimajo celične stene. Na primer: spol Mikoplazma, sferoplast, Ureaplasma, L Obrazci in protoplasti.

Poleg tega bakterije z bakterijami, bogatimi z mikoličnimi kislinami, kot so mikobakterije, in znotrajcelične bakterije, kot sta Chlamydias in Rickettsias.

Prav tako je neučinkovito barvati večino spirokemalnih bakterij.

Obstajajo bakterije istega rodu, ki jih lahko opazimo v istem vzorcu kot gram -pozitiven in kot gram -negativni. Ko se to zgodi, se imenuje obarvanje s spremenljivim gramom, kar je lahko posledica sprememb v hranilih, temperaturi, pH ali koncentraciji elektrolitov.

Pogoste napake

Okrasite pretirano

Pretiravanje v razbarvanju lahko povzroči opazovanje lažno gram -negativnih mikroorganizmov.

Ne čakajte na dovolj časa sušenja, da dodate potopno olje

Ta napaka povzroči nastanek micelov maščob, ki ovirajo opazovanje prisotnih struktur. To se zgodi, ko se olje pridruži molekulam vode, ki so prisotne v vonju.

Vložite vrstni red reagentov

Takšna napaka bo ustvarila gram -negativne bakterije, ki jih je treba vizualizirati, to je lažno gram -pozitivno.

Uporabite stare pridelke (trdne snovi ali tekočine)

Lahko povzroči gram -pozitivne bakterije, da obarvajo gram -negativno (gram -negativno napačno). To se zgodi, ker je pri starih pridelkih verjetno, da obstajajo mrtve ali poslabšane bakterije, v teh pogojih.

Uporabite zelo staro raztopino Lugola

Sčasoma Lugol izgubi lastnosti in njegova barva bledi. Če se uporablja že degenerirani reagent, to ne bo dobro pritrdilo vijoličnega stekla, zato obstaja možnost, da dobite vizualizacijo lažno gram -negativnih mikroorganizmov.

Modro ozadje

Pravilno razbarvano ozadje bo rdeče. Modro ozadje kaže, da je bilo razbarvanje nezadostno.

Reference

1. Hiše-Rincón, g. (1994). Splošna mikologija. Centralna univerza v Venezueli.
2. Gramovo obarvanje. Vzeto iz njega.Wikipedija.org.
3. González, m., González, n. (2011). Priročnik za medicinsko mikrobiologijo. Direktorat za medije in publikacije Univerze v Carabobu.