Oksidazna testna podlaga, postopek in uporabe

The Oksidazni test To je diagnostična metoda, ki prikazuje prisotnost encimskega kompleksa, imenovanega citokrom oksidaza C. Ta sistem sproži transformacijo zmanjšanega v oksidirani citokrom, saj zajame kisik in to posledično deluje kot zadnji sprejemnik elektronov (H⁺) V dihalni verigi.

Izraz oksidaze je povzeti način sklicevanja na encim citokrom oksidaze, znan tudi kot oksidazni indefenol. V starih časih je bilo verjeti, da sta encima citokroma oksidaze in indeofenola oksidaze dva različna encima, danes pa je znano, da so enaki.

Pozitiven in negativni test oksidaze. Vir: Noben strojno berljiv avtor. Alfa.Prim ~ Commonswiki je domneval (na podlagi zahtevkov za avtorske pravice). [Javna domena]

Citokromi so hemoproteini, ki vsebujejo železo in dokončajo sistem citokrom oksidaze. Citokromi se lahko razlikujejo od ene vrste do druge.

Obstajajo različne sorte citokromov (citokromi A1, A2, A3 in 0). Nekatere bakterije lahko proizvajajo samo eno, druge pa do dva ali tri hkrati. V tem smislu je prisotnost citokroma A in A3 znana kot citokrom - oksidaza C. To je vrsta citokroma, ki zazna test oksidaze.

Žanri Neisseria in Pseudomonas vsebujejo oksidazno C citokor. Ti žanri dajejo pozitiven test oksidaze in jim pomagajo razlikovati od zvrsti Acinetobacter in Stenotrophomonas.

Obstajajo tudi drugi žanri, ki so pozitivna oksidaza.

[TOC]

Osnova

Značilnosti sistema citokrom oksidaze c

Oksidazni sistem cikokroma C deluje na naslednji način: Pozitivni mikroorganizmi o oksidazi uporabljajo kisik za ustvarjanje energije z aerobnim dihanjem. Ta sistem deluje zahvaljujoč prevozu elektronov iz darovalskih snovi, kot je NADH⁺ K prejemanju snovi, v tem primeru kisik.

To ima za posledico energijo (ATP) in vodni peroksid, odvisno od sistema citokroma oksidaze, ki ima mikroorganizem.

Zato je večina pozitivnih bakterij oksidaze tudi pozitivna katalaza, nujen pogoj za odpravo vodikovega peroksida, saj je ta snov strupena za bakterije.

Oksidazni C citokorski sistem je prisoten v nekaterih aerobnih bakterijah, nekaterih neobveznih anaerobnih, pomanjkljivih mikroaerofilnih in brez stroge anaerobne. Slednje je razumljivo, saj strogi anaerobi ne morejo živeti v prisotnosti kisika, zato nimajo citokromskega oksidaznega sistema.

Načelo dokazov

V tem testu uporabite snovi, ki delujejo kot umetni sprejemniki elektronov, nadomeščajo domorodce v transportni verigi elektronov.

V glavnem se uporabljajo barvila, kot sta parafenilendiamin in indofenol, ki delujejo kot receptorski substrati in umetni darovalci elektronov.

Parafenyndiamin je oksidiran s sistemom citokroma oksidaze C. Barvilo v svoji zmanjšani obliki je brezbarvno, v oksidirani obliki pa je obarvano.

Tako je prisotnost citokrom oksidaze C sistema C; No, pozitivna reakcija bo ustvarila sivko ali modro obarvanost -púrpura, odvisno od uporabljenega reagenta.

Vam lahko služi: paleobiologija: zgodovina, specialitete, odkritja

Po drugi strani pa, če je zadnja snov sprejemanja elektronov v dihalni verigi drugačna od kisika, bo test oksidaze dal negativno (ni proizvodnje barve); To je primer anaerobnih mikroorganizmov.

Prav tako, če je citokrom, ki ga uporablja mikroorganizem, drugačen od citokrom oksidaze C, bo dal tudi negativni test.

Postopek

Za test oksidaze je več reagentov in protokolov, vsi z enakim namenom.

Reagenti

Kovacs Reactive, Gordon in McLeod Reagent, Nadi Reagent, Carpenter Reagent, Suhrland in Morrison ter uporaba diskov oksidaze.

-Kovacs oksidazni reagent

Sestavljen je iz tetrametil-P-fenilendiamina diklorhidrata pri 1%.

Reagent Kovacs pripravimo z raztapljanjem 1 GR snovi, omenjene v 50 ml destilirane vode. Se subtilno segreje, dokler se njegova skupna rešitev. Prenos v jantarno steklenico zadostne zmogljivosti in dopolnjujte prostornino pri 100 ml z destilirano vodo. Počakajte vsaj 15 minut, preden uporabite. Prihranite v hladilniku, zaščiteno pred svetlobo.

Zavrtimo se kot kovacs oksidazni reagent, da ga razlikuje od reagenta Kovacs, ki se uporablja za razkritje indolskega testa. Ta reagent je najbolj občutljiv, manj strupen, a dražji od ostalih reagentov.

Pozitivna reakcija bo dokaz. Negativna reakcija je dokazana, ker v koloniji ni spremembe barve ali pa je potrebna rahla roza obarvanost. Tudi medij lahko zatemni, vendar to ne pomeni pozitivne reakcije.

S tem reagentom je reakcijski čas ključnega pomena, da se sprememba barve, ki se pojavi med 5 in 15 sek.

-Gordon in McLeod Reagent

Sestavljen je iz dimetil-P-fenilendiamina diklorhidrata, znan tudi kot N-dimetil-P-fenilendiamin ali p-aminodimetilanilin p-amokorhidrat. Pripravljen je, kot je opisano za reagent Kovacs oksidaze, ki nadomešča vpleteno snov.

Ta reagent je nekoliko bolj stabilen od reagenta Kovacs oksidaze, čeprav so vsi reagenti, ki vsebujejo P-penilendiamin, nestabilni.

Ta reakcija je pozno.

-Nadi reagent

Sestavljen je iz 1% α-naftola v etilnem alkoholu (95% etanola) in 1% amin-limanilina. Zmes pripravimo v enakih delih in uporabimo absolutni etilni alkohol kot dinient, dokler se zadostna količina ne konča za 100 ml.

-Carpenter Reactive, Suhrland in Morrison

Sestavljen je iz 1% p-aminodimetilalaninskega oksalata. Pripravite se na enak način kot opisano za reagent Kovacs oksidaze, ki se spreminja za ustrezno snov.

Vam lahko postreže: prehranska veriga džungle

S pripravljeno raztopino so reaktivni trakovi pripravljeni na naslednji način: Whatman 6-8 cm številka 1.

Dovoljeno jih je, da se posušijo, ne da bi imeli stik s kovino, shranite v kozarcih z sušilnico in hranite v hladilniku. Ti trakovi so stabilni do 6 mesecev.

Je najbolj stabilen reagent vseh omenjenih, ki lahko traja do 6 mesecev. Druga točka je, da se medij ne obarva okoli kolonije, če se uporablja neposredno na plošči.

Videz rdeče barve se razlaga kot pozitiven test.

-Oksidazni diski

So komercialni diski, ki so impregnirani z reagentom za test oksidaze. Na trgu je več komercialnih blagovnih znamk.

Njegova uporaba je precej praktična, saj ne smemo pripraviti svežih reagentov, kar olajša delo. Pridobljeni rezultati so zanesljivi, če so diski pravilno ohranjeni.

Protokoli

Metoda neposredne plošče, posredna metoda na papirju in uporaba impregniranih diskov z oksidaznimi reagenti.

-Metoda neposredne plošče

2 ali 3 kapljice katerega koli od zgoraj omenjenih reagentov so v ta namen dodane neposredno na kolonije (-e), ki jih vsebuje kulturna srednja plošča, ki ne vsebuje glukoze.

Sprememba ali ne barva kolonij se razlaga, ne pa medij. Veljaven reakcijski čas je odvisen od uporabljenega reagenta.

-Posredna metoda na papirju

Odrežite kos filtrirnega papirja (whatman n ° 1) na velikost 6 cm² In je postavljen v prazen petri.

Dodajte 2 ali 3 kapljice reagenta Kovacs oksidaze na papir, sodelujte v koloniji, ki jo želite študirati s platinasto ročajem ali leseno palico in jo iztegnite v ravni črti na impregniranem reagentnem papirju. Razlagati v obdobju od 5 do 10 sekund.

S trakovi, pripravljenimi s mizarjem, Suhrland in Morrison Reagent, se kolonija razprostira na suhem traku. Isti trak služi za poskus več sevov. Razlagate na 10 sek.

-Diski (mneposreden eton)

Subtično navlažite komercialne diske s sterilno destilirano vodo in premagajte kolonijo za študij. Priporočljivo je, da uporabite plošče pri 35 ° C, če se plošče uporabljajo pri sobni temperaturi ali hladilnih ploščah, reakcija je nekoliko počasnejša. Razlaga spremembo barve med 10 in 20 sek.

Kolonije, ki jih vsebuje kri ali čokolado.

-Diski (posredna metoda)

Navlažite album, kot je opisano zgoraj. Postavite ga na prazen petri. Vzemite zadostno količino kolonije za študij s platinasto ročajem ali leseno palico in postavite na disk. Razlaga spremembo barve med 10 in 20 sek.

Uporaba

Rod Neisseria in Acinetobacter včasih veliko morfološko spominjata.

Vam lahko služi: limnologija

V tem primeru je test oksidaze res uporaben. Neisseria spola je pozitivna in negativna acinetobacter.

Vendar je rod Moraxella zelo podoben rodu Neisseria in oba dajeta pozitivno reakcijo; Zato moramo vedno izvajati preskuse fermentacije ogljikovih hidratov za dokončno identifikacijo.

Po drugi strani je test oksidaze uporaben za razlikovanje bakterije, ki pripada družini Enterobacteriaceae (vsa negativna oksidaza) drugih fermerjev, kot so rod pašnikov, aeromoni, plesiomonas (pozitivna oksidaza).

Rod Vibrio in Helicobacter sta tudi pozitivna oksidaza.

QA

Uporabite znane seve Escherichia coli kot negativni nadzor in sevi Pseudomonas aeruginosa kot pozitiven nadzor.

Omejitve

-Reagente je treba uporabiti sveže pripravljene, njihova življenjska doba v sobni temperaturi je kratka, ker so zelo nestabilni. V hladilniku lahko traja med 5 dnevi do 2 tedna.

-Reagenti so brezbarvni, če spremenijo barvo, jih je treba zavreči. Poškodovani diski so očitni, ker se sčasoma temni.

-Pozitivna reakcija z oksidaznim reagentom Kovacs med 15 -60 sec se šteje za zamudo reakcije, po 60 sekundah.

-On Haemophylus influenzae Daje negativno reakcijo oksidaze, če se uporabi kateri koli reagent z dimetil-P-fenilendiaminom, vendar pozitiven, če je uporabljen reagent oksidaze Kovacs (tetrametil-P-fenilendiamin)).

-Mediji, ki vsebujejo glukozo, vmešavajo v test, lažno negativni.

-Sevi Bordetella oslovski kašelj Lahko dajo lažno pozitivno reakcijo, če prihajajo iz zelo koncentriranih krvnih agar plošč.

-Uporaba kovinskih ročajev (železa), ki daje lažno pozitivno reakcijo.

priporočila

-Ker so reagenti zelo nestabilni in se ponavadi samostojno.

-Drug način za odložitev samostojnega reagenta je dodajanje 0,1% askorbinske kisline v času priprave reagentov.

-Ker so reagenti nestabilni, je priporočljivo izvajati tedenski nadzor kakovosti.

-Reagentov, ki ne opravijo testa za nadzor kakovosti.

Reference

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiološka diagnoza. 5. izd. Pan -ameriški uredništvo s.Do. Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld a. (2009). Mikrobiološka diagnoza Bailey & Scott. 12 ed. Pan -ameriški uredništvo s.Do. Argentina.
3. "Oksidazni test." Wikipedia, brezplačna enciklopedija. Jan 2018, 10:32 UTC. April 2019, 14:03
4. Svetovna zdravstvena organizacija. Laboratorijski priročnik za identifikacijo in testiranje dovzetnosti za antimikrobije bakterijskih patogenov, pomembnih za javno zdravje v razvojnem svetu.2004. Na voljo pri: Kdo.Int/Drugresistance/Infosharing
5. Reaktivni trakovi za diagnozo aktivnosti oksidaze pri bakterijah. Kubanski rev. 2000; 52 (2): 150-151.