Bradford metoda Kaj je, načeloma, reagenti, uporablja

On Bradford metoda Gre. Uporablja se na številnih področjih bioloških, medicinskih, veterinarskih, agronomskih raziskav itd.

Znana je kot "Bradford metoda", ker ga je Marion Bradford prvič opisala leta 1976 v svoji publikaciji z naslovom Hitra in občutljiva metoda za kvantifikacijo beljakovin v količini mikrogramov z uporabo načela beljakovinske-mlade zveze.

Fotografija plošče ELISA, kjer so se vzorci pripravili na količinsko določitev Bradforda (vir: Helito, CC by-SA 4.0, prek Wikimedia Commons)

Od svojega predloga je bila ta metoda popularno popularizirana, saj je prepoznana bolj občutljiva kot druge metode kvantifikacije beljakovin (na primer Lowry in Biuret); bolj stabilna kompleksna oblika in je ekonomična in enostavna za izvedbo.

Poleg tega se je pokazalo, da imajo reagenti, ki jih uporabljajo, zelo malo vmešavanja v spektrofotometrične meritve v različnih pogojih.

[TOC]

Načelo metode

Bradfordova metoda temelji na kvantifikaciji barvnih sprememb raztopine zaradi zveze - v kislih pogojih - beljakovinskih molekul vzorca z molekulami posebnega barvila: Coomassie Blue Briljantno modra G250.

Ko se to barvilo doda v beljakovinsko raztopino, se veže na te molekule skozi elektrostatične sile in ta reakcija dokazuje kot rdečkasto rjava barva v modro do modro.

Beljakovine in aminokisline

Tako kot telo tvori veliko celic, in nukleinske kisline (na primer DNK in RNA) tvorijo nukleotidi, beljakovine tvorijo z urejenimi zaporedji nekaterih molekul, znanih kot aminokisline.

Aminokislina je molekula, sestavljena iz osrednjega ogljikovega atoma, na katerega so združene 4 različne kemične skupine: atom vodika, karboksilna skupina, amino skupina in skupina ali stranska veriga, ki daje identiteto.

Obstaja 20 aminokislin, ki so pogoste za vse beljakovine, ki se med seboj razlikujejo glede na lastnosti svojih stranskih skupin: obstajajo osnovne aminokisline, kisline, polarne, apolarne, ciklične, aromatične itd.

Vam lahko služi: Shelfordov zakon o toleranci: kaj je in primeri

Vsota značilnosti teh aminokislin in vrstni red, v katerem se pridružijo, da tvorijo beljakovinsko strukturo.

Kompleks odtenkov-beljakovin

Bradfordova metoda torej količinsko opredeljuje prisotnost aminokislinskih ostankov osnovnih značilnosti v bioloških vzorcih, zlasti aminokislinah, kot so arginin, lizin in histidin, ki so tiste, ki jih je lažje namestiti s Coomassie Blue.

Barvne spremembe so količinsko opredeljene kot razlike v absorbanci vzorcev, ki se meri s spektrofotometrom, prilagojenim valovnim dolžino 595 nm.

Kaj je absorbanca?

Znana je tudi kot optična gostota in določa količino svetlobe, ki jo absorbira rešitev. Ta absorpcija je odvisna od valovne dolžine svetlobe, ki se uporablja za obsevanje raztopine, saj niso vse molekule sposobne absorbirati isto valovno dolžino.

Ta pojav je bil povzet v zakonu, znanem kot zakon Beer-Lamberta, ki vzpostavlja razmerje med zmanjšanjem količine svetlobe, ki poteka skozi snov, in lastnostmi omenjene snovi.

Na primer, ko se svetloba prenaša skozi raztopino, obstajata dva ukrepa intenzivnosti: intenzivnost (pred prečkanjem raztopine) in prenosna intenzivnost (na splošno nižja, kar ustreza deležu svetlobe, ki ga raztopina ni absorbirala).

Razmerje med obema vrednostma je tisto, kar je znano kot obdelava, in ima vrednosti med 0 in 1 ali se izraža v odstotkih.

Absorbanca je povezana s predelavo logaritmičnega načina, zakon Beer-Lamberta pa predlaga linearno razmerje med absorbanco raztopine in njegovo koncentracijo, njegovim koeficientom molskega izumrtja in optičnim koeficientom raztopine; Matematična enačba, ki opisuje ta zakon, je naslednja:

Vam lahko služi: škodljiva favna: vzroki za širjenje, posledice, nadzor

A (absorbanca) = ε (molski koeficient izumrtja) C (koncentracija) L (dolžina lahke prehode)

Koncentracija raztopine se izračuna s čiščenjem omenjene enačbe in izvedbo ustreznih izračunov (C = A/εl)

Kaj je spektrofotometer?

To je naprava, ki se uporablja za količinsko določitev količine svetlobe (odvisno od valovne dolžine), ki absorbira molekule v raztopino ali, z drugimi besedami.

Spektrofotometri delujejo tako, da oddajajo žarek svetlobe (vidni ali ultravijolični), ki gre skozi prizmo (ali napravo, znano kot Monokromator difrakcijskega omrežja), ki ga razčleni v različnih valovnih dolžinah, ki ga sestavljajo, kar omogoča, da "izbere" določeno dolžino.

Ta svetloba se prenaša skozi posebno cev, ki vsebuje vzorec, ki je analiziran, in nato doseže detektor, ki zaznava količino svetlobe, ki se prenaša iz omenjenega vzorca (ki se ni absorbirala), ki jo je mogoče pozneje opaziti zahvaljujoč "tolmaču" ima grafični vmesnik.

Barvilo: coomassie modra Briljantno modra G 250

Najpomembnejši reagent te metode je brez dvoma barvilo, ki se uporablja za "označevanje" beljakovin v vzorcu. Bradford je predlagal svoje delo, ker ta barvilo obstaja na dva načina: eno rdeče in eno modro. Rdeča oblika postane modra oblika, ko se barvilo veže na beljakovine in tvori kompleks.

Modro beljakovinski kompleks ima zelo visok molski koeficient iztrebljanja, kar ima za posledico večjo občutljivost za kvantifikacijo koncentracije beljakovin v analiziranih vzorcih.

Reagenti

Čeprav se rešitev, ki se uporablja za to metodo kvantifikacije, na splošno trži v zaprtih posodah, že pripravljeni -"Bradford Reactive" -, so uporabljeni glavni reagenti:

- Coomassie Blue Briljantno modra G50 (0.01% w/v)

- Fosforna kislina (8.5 % w/v)

- Etanol (4.7% w/v)

Komplet za kvantifikacijo beljakovin po Bradfordovi metodi (vir: Vivo Rolfe, CC BY-SA 4.0, prek Wikimedia Commons)

Kot v kateri koli metodi in protokolu za kvantifikacijo beljakovin s spektrofotometričnimi metodami, je treba imeti "standardni" ali "standardni" protein, da se izvede a Kalibracijska krivulja določiti vrednosti absorbance, povezane z različnimi koncentracijami beljakovin; Na splošno se uporablja goveji serumski albumin.

Vam lahko postreže: čokoladni agar

Metoda je sestavljena iz mešanja nekaterih količin vzorcev problem z določenimi zvezki Bradfordovega reagenta; Počakajte nekaj minut, da je medsebojno delovanje in sprememba barv in sprememba barv očitna, nato pa izmerite in zabeležite vrednosti absorbance, da izvedete kasnejše izračune.

Uporaba/aplikacije

Bradfordova metoda je ena izmed metod kvantifikacije ali ocenjevanja najbolj uporabljene koncentracije beljakovin na svetu, predvsem zaradi nizkih stroškov, do hitrosti, s katero se rezultati pridobijo, do velike stabilnosti med beljakovinami in barvilom, do njegova obnovljivost in najmanjše motnje, ki jih imajo komponente reagentov med meritvijo.

Metoda se uporablja v več sto različnih znanstvenih aplikacijah za določanje beljakovin v različnih okoliščinah: fiziološke, citološke, imunološke, klinične, industrijske (zlasti v živilski industriji) itd.

Eksperimentalno je ta metoda zelo uporabna za:

• Spremljajte količino beljakovin, ki jih vsebuje količina, ki se postopoma prinaša iz kromatografskega stolpca (v afinitetnih stolpcih, izmenjava ionov, absorpcija, filtracija gela).in. Analizirajte frakcije protokolov za čiščenje beljakovin.
• Spremljajte količino beljakovin, naloženih v gel za elektroforezo.
• Ocenite količino beljakovin, pridobljene v sistemu prekomerne ekspresije.

Reference

1. Bonjoch, n. Str., & Tamayo, str. R. (2001). Kvantifikacija vsebnosti beljakovin po metodi Bradford. V priročniku rastlinskih ekofizioloških tehnik (PP. 283-295). Springer, Dordrecht.
2. Bradford, m. M. (1976). Hitra in občutljiva metoda za kvantitacijo mikrogramov količin beljakovin z uporabo glavne vezave na dan beljakovin. Analitična biokemija, 72 (1-2), 248-254.
3. Kielkopf, c. L., Bauer, w., & Urbatsch, jaz. L. (2020). Bradford test za določanje koncentracije beljakovin. Protokoli hladnega spomladanskega pristanišča, 2020 (4), PDB-Prot102269.
4. Sapan, c. V., Lundblad, r. L., & Price, n. C. (1999). Tehnike testiranja kolorimetričnih beljakovin. Biotehnologija in uporabna biokemija, 29 (2), 99-108.
5. Walker, J. M. (Ed.). (devetnajst devetdeset šest). Priročnik za beljakovinske protokole (vol. devetnajst devetdeset šest). Springer Science & Business Media.