Imunofluorescenčna fundacija, protokol in aplikacije

The imunofluorescenca To je močna imunomarcy tehnika, ki uporablja protitelesa, združena, kovalentno za fluorescenčne molekule, za prepoznavanje specifičnih ciljev v celičnih vzorcih, pritrjenih na trdni podpori.

To tehniko mikroskopsko opazovanje z imunsko specifičnostjo, kar omogoča opazovanje živih ali mrtvih celic, ki imajo lahko majhne količine antigenov. Široko se uporablja tako na področju raziskav kot pri klinični diagnozi različnih patologij.

Imunomaričnost aktinskih filamentov v kardiomiocitnih celicah (vir: PS1415 [CC BY-SA 4.0 (https: // creativeCommons.Org/licence/by-sa/4.0)] prek Wikimedia Commons)

Ta predvsem kvalitativna tehnika (z nekaterimi kvantitativnimi različicami) mora narediti posebej z vizualizacijo vzorca s produktom fluorofore.

V celičnem kontekstu je zelo koristno preučiti prisotnost/odsotnost in podcelično lokacijo beljakovin. Tehnika je bila uporabljena pri začetkih na kliničnem področju za diagnozo virusov, kot je gripa, in posledično za številne druge nalezljive bolezni.

To je tehnika velike občutljivosti in s pravilno ekipo za mikroskopijo ima lahko zelo dobro ločljivost. Za njegovo opazovanje zahteva uporabo konfokalnih ali epifluorescenčnih mikroskopov.

Kljub temu, da ste zelo priljubljeni, lahko predstavite nekaj pomembnih težav v zvezi z pridobivanjem nespecifične fluorescence, ki v ozadju ustvari določen "hrup", kar pogosto omejuje pravilno branje rezultatov.

[TOC]

Osnova

Imunofluorescenca temelji na izkoriščanju biološkega pojava reakcije interakcije med protitelesom in antigenom. To mora storiti posebej z vizualizacijo ali odkrivanjem te reakcije, ko vznemirljive fluorescentne molekule pri določeni valovni dolžini.

Protitelo je imunoglobulinski protein, izločen iz aktivnih B celic, in je posebej ustvarjen proti antigenu, ki se lahko pridruži z veliko afiniteto in specifičnostjo. Imunofluorescenca uporablja IgG imunoglobuline, ki jih v krvnem serumu najdemo topne.

Protitelesa so molekule do 950 kDa, sestavljenih iz dveh kratkih peptida (svetlobe) in dveh dolžin v obliki "y" (težka). Tako lahke kot težke verige so razdeljene na dve domeni: ena spremenljivka, ki lahko prepozna antigen, in drugo konstantno ali ohranjeno, značilno za vsako vrsto.

Antigeni so funkcionalno opredeljeni kot molekule, ki jih lahko prepoznamo s protitelesom in so večinoma beljakovine. Ko je žival izpostavljena antigenu, se aktivirajo limfociti imunskega sistema, ki ustvarjajo specifična protitelesa proti njej in delujejo kot obrambni sistem.

Antigen, kot je na primer protein, ima lahko več kot en epitop ali kraj prepoznavanja za protitelo, zato ima lahko serum živali, ki je izpostavljena antigenu.

Lahko vam služi: povrhnjica čebule

Nato imunofluorescenca izkorišča sposobnost živali, da proizvaja poliklonalna protitelesa proti specifičnemu antigenu, da bi jo očistila in kasneje uporabila za odkrivanje istega antigena v drugih okoliščinah.

Med najbolj uporabljenimi fluorescentnimi barvili ali molekulami za nekatere tehnike imunofluorescence so fluorescein izooticianat (FITC), tetrametilrodamin-5 in 6 (TRITC) izohianat, veliko cicaanov, kot so Cy2, Cy5 in Cy7, in DYE, imenovane Alexa Fluroor® Fluor®448.

Protokol

Imunofluorescenčni protokol se razlikuje glede na številne dejavnike, na splošno pa obsega linearno zaporedje korakov, sestavljeno iz:

• Priprava listov in celic
• Vzorčna fiksacija
• Permeabilizacija
• Blokiranje
• Imunotivni ali imunomarcaje
• Montaža in opazovanje

-Priprava

Vzorcev

Priprava vzorcev bo odvisna od njihove narave in vrste izkušenj, ki jih je treba izvesti. Nato bo razložen najpreprostejši primer, ki pomeni uporabo suspendiranih celic.

Suspenzivne celice, to je v tekočem kulturnem mediju, je treba najprej ločiti od tega s centrifugiranjem in jih nato oprati z pufersko raztopino ali "HAMBER " izosmotski, ki ohranja njegovo integriteto.

Običajno se uporablja fosfatno-salinski pufer, znan kot PBS, v katerem celice resuspendirajo.

Listov

Listi, ki se uporabljajo za mikroskopsko opazovanje, kjer bodo celice nastavljene za ustrezne obdelave na nižji stopnji, morajo biti tudi skrbno pripravljeni.

Te so pokrite ali "senzibilizirane" s polisinsko raztopino, sintetičnim polimerom, ki bo služil kot "molekularno lepilo" med celicami in trdno podporo, zahvaljujoč elektrostatični interakciji med pozitivnimi naboji njihovih amino skupin in negativnimi obremenitvami beljakovin, ki pokrivajo celice.

Vzorčna fiksacija

Ta postopek je sestavljen iz imobilizacije beljakovin, ki so v celični notranjosti, da bi ohranili njihovo prostorsko lego nedotaknjeno. Uporabljene molekule bi morale biti sposobne prečkati vse vrste celičnih membran in oblikovati okvirje s kovalentnimi beljakovinami.

Formaldehid in paraformaldehid, glutaraldehid in celo metanol se široko uporabljajo, s katerimi se celični vzorci inkubirajo za določen čas in jih nato umivajo z izosmotsko puferno raztopino.

Po fiksaciji celic se jim še naprej pridružuje predhodno senzibiliziranim listom s polisinom.

Permeabilizacija

Glede na vrsto opravljenega testa bo potrebno za permeabilizacijo ali ne v študijskih celicah. Če je tisto, kar iščemo, poznati lokacijo, prisotnost ali odsotnost določenega proteina na celični površini, permeabilizacija ne bo potrebna.

Vam lahko služi: fosfatidilinozitol: struktura, usposabljanje, funkcije

Po drugi strani pa je, če želite vedeti lokacijo beljakovin znotraj celične notranjosti, permeabilizacija nepogrešljiva in bo sestavljena iz inkubacijskih vzorcev s Triton X-100, detergentom, ki lahko prepušča celične membrane.

Blokiranje

Temeljni korak v vseh imunoloških tehnikah je blokiranje. Na tej stopnji postopka je blokada sestavljena iz pokrivanja v senzibiliziranih listih, vsa mesta s poliezinskimi molekulami, na katere se celice niso držale. To pomeni, da preprečuje kakršno koli nespecifično sindikat.

Običajno za blokiranje rešitev z albuminom Whey goveja (BSA) se uporabljajo v PBS medpomnilnikom in najboljši rezultati so pridobljeni, dlje je, da je inkubacijski čas s to rešitev. Po vsakem koraku, vključno z blokado, je treba preostalo rešitev odstraniti s pranjem.

Imunotivni ali imunomarcaje

Postopek imunomaričnosti ali imunomaričnosti bo odvisen predvsem, če gre za neposredno ali posredno imunofluorescenco (glej pozneje).

Če gre za primarno ali neposredno imunofluorescenco, se vzorci inkubirajo z želenimi protitelesi, ki jih je treba povezati s fluorescentnimi barvili. Postopek inkubacije je sestavljen iz redčenja protiteles v raztopini, ki jo bo vsebovala tudi BSA, vendar v nižjem deležu.

Kadar je primer sekundarne ali posredne imunofluorescence, je treba narediti dve zaporedni inkubaciji. Najprej z želenimi protitelesi in nato s protitelesi, ki lahko zaznajo konstantna območja primarnih imunoglobulinov. Prav ta sekundarna protitelesa so kovalentno združena s fluorofori.

Tehnika je zelo vsestranska, kar omogoča hkratne oznake več kot enega antigena na vzorec, če imajo primarna protitelesa, povezana z različnimi fluorofori, v primeru neposredne imunofluorescence.

Za hkratne oznake v posredni imunofluorescenci je potrebno.

Tako kot blokada tudi inkubacija s protitelesi daje boljše rezultate, večji je čas tega. Po vsakem koraku je treba oprati odvečna protitelesa, ki se niso pridružili vzorcem, v sekundarni imunofluorescenci.

Nekatere tehnike uporabljajo druga barvila, ki nimajo nobene zveze z imunomaričnostjo, kot je jedrsko obarvanje z DAPI fluorofore.

Montaža in opazovanje

V končnem času inkubacije s fluorofori je potrebno, da vzorci ostanejo v temi. Za opazovanje mikroskopa je običajno.

Fantje

Grafični povzetek neposredne in posredne imunofluorescence (vir: Westhayl618 [CC BY-SA 4.0 (https: // creativeCommons.Org/licence/by-sa/4.0)] prek Wikimedia Commons)

Neposredna ali primarna imunofluorescenca

To je povezano z odkrivanjem antigenov z uporabo fluorescentnih protiteles. Glavna prednost uporabe te tehnike je njegova hitrost, vendar se lahko v procesu pojavijo številni primeri nespecifične zveze, zlasti pri preučevanju človeške serume, saj so bogate z zelo heterogenimi protitelesi.

Vam lahko služi: 5 vej glavne biotehnologije

Posredna ali sekundarna imunofluorescenca

Znana je tudi kot tehnika "sendvič", kar pomeni razvoj tehnike v dveh korakih. Prva je povezana z uporabo nefluorescenčnega protitelesa in njene zveze za antigen, ki vas zanima.

Proti konstantni regiji tega prvega protitelesa (ki bo zdaj služilo kot antigen) se uporablja drugo protitelo, ki ga je mogoče prepoznati, ki je povezana s fluorescentno molekulo.

Videz fluorescenčnega signala bo rezultat specifičnega prepoznavanja med prvim nefluorescenčnim protitelesom in antigenom, ki ga zanima; Prisotnost tega prvega protitelesa pogojev drugega, kar je označeno in zahvaljujoč se lahko določi prisotnost ali odsotnost antigena.

Kljub temu, da je tehnika, ki porabi veliko dlje kot neposredna imunofluorescenca (ker vključuje bolj inkubacijski korak), ta tehnika ne pomeni zasnove fluorescentnega protitelesa za vsak antigen, ki je raziskan, kar je v ekonomskem smislu bolj uspešno.

Poleg tega gre za občutljivejšo tehniko glede na ojačanje signala, saj se lahko več kot eno sekundarno protitelo pridruži konstantnemu območju primarnega protitelesa in tako poveča intenzivnost fluorescentnega signala.

Prijave

Kot smo že opazili, je imunofluorescenca izjemno vsestranska tehnika, ki ji je bila podana množica uporabe na znanstvenem in kliničnem področju. Uporablja se lahko za odgovor na ekološka, ​​genetska in fiziološka vprašanja v zvezi s številnimi organizmi.

Med kliničnimi aplikacijami se uporablja za neposredno diagnozo nekaterih dermatoloških bolezni, bodisi z uporabo neposredne ali posredne imunofluorescence na epitelijskem tkivu bolnikov, ki so jih preučevali.

Tehnike imunofluorescence so bile razporejene v enoceličnih organizmih, kot so kvasovke za vizualizacijo intranuklearnih in citoplazemskih mikrotubul, aktina in pripadajočih beljakovin, 10nm filamentov in drugih sestavin citoplazme, membranskih in celičnih zidov.

Reference

1. ABCAM, imunocitokemija in imunofluorescenčni protokol. Pridobljeno iz Abcama.com
2. Greph, c. (2012). Fluorescentna barvila. Pridobljeno iz Leica-Microsystems.com
3. Miller, d. M., & Shakest, D. C. (devetnajst devetdeset pet). Imunofluorescentna mikroskopija. V Metode v celični biologiji (Vol. 48, str. 365-394). Academic Press, Inc.
4. Odell, i. D., & Cook, D. (2013). Imunofluorescenčne tehnike. Časopis za preiskovalno dermatologijo, 133, 1-4.
5. Princ, b. J. R., Adams, a. In. M., Druain, d. G., & Brian, k. (1991). Metode imunofluorescence za YEA. V Metode encimologije (Vol. 194, str. 565-602). Academic Press, Inc.
6. Schaeffer, m., Orsi, npr. V, & Widelock, D. (1964). Uporaba imunoflorence v virologiji javnega zdravja. Bakteriološki pregledi, 28(4), 402–408.
7. Vrieling, e. G., & Anderson, D. M. (devetnajst devetdeset šest). Imunofluorescenca v raziskavah fitoplanktona: aplikacije in potencial. J: Phycol., 32, 1-16.