Značilnosti DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol), temelj, uporaba

On DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) Barvilo je, da s svojo fluorescentno lastnostjo služi kot marker, ki se med drugim pogosto uporablja v fluorescenčni ali pretočni citometrijski mikroskopiji. Fluorescenca, ki jo oddaja, je svetlo modra, njegovo navdušenje se pojavi med 455-461 nm (UV svetloba).

DAPI barvilo lahko z veliko lahkoto prečka celično membrano iz mrtvih celic. Prav tako lahko barvate jedra v živo, toda v tem primeru mora biti koncentracija tega večja.

Kemična struktura fluorescenčnega dista. Vir: Slika: Datoteka: DAPI.SVG je vektorska različica te datoteke. Namesto te rastrske slike ga je treba uporabiti, kadar ni nižji/Richard Wheeler (Zephyris) [cc by-sa 3.0 (http: // creativeCommons.Org/licence/by-sa/3.0/)] urejena slika

Barvilo je sposobno dostopati do celične DNK, skozi katero ima posebno afiniteto in se z veliko avidnostjo združuje z adeninskimi in timinskimi dušikovimi bazami. Zaradi tega je zelo koristno v nekaterih tehnikah molekularne biologije.

Ta spojina spada v skupino indoličnih barvil in je pokazala, da ima večjo občutljivost na DNK kot etidijev bromid in zastrašujoč jodid, zlasti o agaroznih gelih.

Uporaba tega fluorescentnega barvila je zelo široka, saj je uporabna za: preučevanje sprememb DNK v apoptotičnih procesih (celična smrt) in zato zaznavanje celic v tem procesu; Za fotografijo odtisa DNK (fotografsko tiskanje DNK); preučiti bakterijsko kontaminacijo; o Za vizualizacijo jedrske segmentacije.

Uporabljali so ga tudi pri preučevanju kromosomskih pasov, pri odkrivanju DNK Mycoplasmas sp, Pri interakciji z DNK-beljakovine pri obarvanju in štetju celic z imunofluorescenco in celo barvanje zrelih cvetnega prahu.

[TOC]

Značilnosti

DAPI je okrajšava njegovega kemijskega imena (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol). Njegova molekularna formula je c₁₆H_petnajstN_5. Ima molekulsko maso 350,3. V bližini UV svetlobnega območja (345 do 358 nm) se pojavi največje vzbujanje kompleksa DAP-ADN, medtem ko se največja emisija fluorescence pojavi med 455-461 nm.

Za to barvilo je značilno, da je rumen prah, vendar strukture, označene s tem fluoroforom, oddajajo svetlo modro luč.

Vendar pa je to topna spojina za pospešitev raztapljanja, lahko nanesemo nekaj toplote. Lahko razredčimo s PBS, vendar se ne raztopi neposredno v to.

Lahko vam služi: arsenioso kislina (H3SO3): lastnosti, tveganja in uporabe

Ko je barvilo pripravljeno, ga je treba shraniti v temi, torej zaščiteno pred svetlobo, pri temperaturi 2 do 8 ° C (hladilnik). V teh pogojih je barvilo stabilno več kot 3 tedne ali mesece.

Če je svetloba zaščitena, vendar je njegova stabilnost pri sobni temperaturi do 2 ali 3 tedne, vendar je izpostavljena neposredni svetlobi, je poslabšanje zelo hitro. Če želite prihraniti za veliko dlje.

Osnova

Ta obarvanost temelji na ustvarjanju jedrskega najema v glavnih tehnikah molekularne biologije, kot so: pretočna citometrija, fluorescentna mikroskopija in obarvanje metafaznih kromosomov ali vmesnikov.

Ta tehnika temelji na veliki afiniteti, ki jo ima barvilo za dušikove baze (adenin in Timin), ki jih vsebuje genetski material (DNK) v manjšem utoru. Medtem ko na citoplazemski ravni pušča zelo malo dna.

Ko se zveza fluorescentnega barvila do regij adenina in timine DNK pojavi, se fluorescenca znatno poveča (20 -krat več). Barva, ki jo oddaja, je svetlo modra. Treba je opozoriti, da pri vezavi na osnovne pare GC ni emisije fluorescence (Guanin-citosin).

Pomembno je poudariti, da čeprav ima tudi afiniteto za RNA, ne povzroča težav, ker se večja stopnja oddajanja energije te molekule pojavi na drugo valovno dolžino (500 nm), za razliko od DNK, ki ga naredi 460 nm. Poleg tega je povečanje fluorescence, ko je povezano z RNA, le 20%.

DAPI se bolj uporablja za barvanje mrtvih (fiksnih) celic, ki jih živite, saj je za barvanje slednje potrebno veliko večjo koncentracijo barvila, to je zato, ker je celična membrana precej manj prepustna za DAPI, ko je živ.

DAPI barvilo lahko uporabimo v kombinaciji z rdečimi in zelenimi fluorofori za pridobitev večbarvne izkušnje.

Uporaba

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) je odličen fluorofor in se zato pogosto uporablja v različnih tehnikah in za različne namene. Uporaba DAPI je razložena spodaj v glavnih tehnikah.

Pretočna citometrija

Raziskovalci Gohde, Schumann in Zante leta 1978 so bili prvi, ki so uporabili in predlagali DAPI kot fluorofor v tehniki pretočne citometrije, saj so imeli velik uspeh zaradi visoke občutljivosti z DNK in njeno visoko intenzivnost v emisiji fluorescence.

Lahko vam služi: amino skupina (NH2): struktura, lastnosti, primeri

Uporaba DAPI v tej tehniki omogoča preučevanje celičnega cikla, kvantifikacijo celic in obarvanje živih in mrtvih celic.

Čeprav obstajajo druga barvila, kot so etidijev bromid, hoechst oksid, akridin oranžna in propidio jodid, je DAPI eden najbolj uporabljenih za bolj fotografiranje od zgoraj omenjenih.

Za to tehniko je potrebno. Vzorec je centrifugiran in supernatant zavrže.

Medtem ko čas prehaja DAPI barvilo z obarvanim pufrom (Foxp3 of Biolegend) v 3 µm.

Vzorec centrifugue, zavrzite supernatant in nato pokrijte z 1 ml raztopine DAPI 15 minut pri sobni temperaturi.

Vzorec odnesite do pretočnega citometra z desnim laserjem.

Mikrofluorometrija pretoka

Druga tehnika, v kateri se uporablja dapi. Oba sta koristna za količinsko določitev.

Hibridizacija In situ 

Ta tehnika v bistvu uporablja DNK sonde, označene s fluorescentnim barvilom, ki je lahko DAPI.

Vzorec je potrebno obdelati s toploto, da senaralizira DNK dveh razredov in ga spremeni v dve monokvezni verigi. Nato se hibridizira z dnaizirano DNA sondo, označeno z DAPI, ki ima zaporedje, ki vas zanima.

Nato ga operemo, da odpravimo tisto, kar ni bilo hibrid, kontrast se uporablja za vizualizacijo DNK. Fluorescenčni mikroskop omogoča opazovanje hibridizirane sonde.

Ta tehnika je namenjena zaznavanju specifičnih zaporedij v kromosomski DNK, saj lahko diagnosticirajo nekatere bolezni.

Te cito-molekulske tehnike so bile koristne za določitev podrobnosti v preučevanju kariotipov. Na primer, dokazal je območja, bogata s pari adenozina in timinskih baz, imenovanih heterokromatske regije ali pasovi DAPI.

Vam lahko služi: prepustnost: koncept, enote, dejavniki, primeri

Ta tehnika se pogosto uporablja za preučevanje kromosomov in kromatina pri rastlinah in živalih, pa tudi pri diagnozi prenatalnih in hematoloških patologij pri človeku.

V tej tehniki je priporočena koncentracija DAPI 150 ng/ml za čas 15 minut.

Že nameščeni diapozitivi morajo biti zaščiteni pred svetlobo pri 2-8 ° C.

Obarvanje imunofluorescence

Celice so fiksirane s 4% paraformaldehidom. Če bodo uporabljene druge barvila, DAPI ostane na koncu kot najem in celice z raztopino PBS 15 minut pokrivajo. Medtem ko čas traja, pripravite raztopino DAPI, ki razredči s PBS, tako da je končna koncentracija 300 µm.

Nato presežek PBS 5 minut ekstrahira in prekriva z DAPI. Večkrat oprajte. List opazimo v fluorescenčnem mikroskopu pod ustreznim filtrom.

Varnostni list

To spojino je treba skrbno manipulirati, ker je spojina, ki ima mutagene lastnosti. Za odpravo te spojine vodnih raztopin, ki jih bomo zavrgli, se uporablja aktivirani ogljik.

Za preprečevanje nesreč s tem reagentom je treba uporabiti rokavice, ogrinjala in varnostne leče. Če pride do stika ali sluznice, območje operete z dovolj vode.

Nikoli ne bi smeli opisati tega reagenta z usti, uporabite propipete.

Ne kontaminirajte reagenta z mikrobnimi sredstvi, saj bo to povzročilo napačne rezultate.

Barv DAPI ne razredčite več kot priporočeno, ker se bo kakovost obarvanja znatno zmanjšala.

Reagenta ne izpostavljajte neposredni svetlobi ali hranite toplote, ker zmanjšuje fluorescenco.

Reference

1. Brammer S, Toniazzo C in Poersch L. Običajno podjetniki Cholars Na rastlinski citogenetiki. Arq. Inst. Biol. 2015, 82. Na voljo pri: Scielo.
2. Priši na laboratoriji. DAPI. Na voljo na: Menarinidiagnostics.com/
3. Citocelični laboratoriji. 2019. Navodila za uporabo DAPI. Na voljo na Cycell.com
4. Elaosegi A, Sabater S. Koncepti in tehnike v rečni ekologiji. (2009). Uredniški rube, Španija. Na voljo pri: Knjige.Google.co.GO/
5. NOVAES R, PRENCENT A, TALVANI A, NATALI A, NEVES C, MALDONADO I. Uporaba fluorescence v spremenjeni metodi sektorja za oceno števila miocitov v srčnem tkivu. Arq. Nedrčki. Kardiol. 2012; 98 (3): 252-258. Na voljo pri: Scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Prisotnost fitoplazme v papaju (carica papaja) v Mehiki. Revija Chapingo. Serija vrtnarstva, 2011; 17 (1), 47–50. Na voljo na: Scielo.org.