Značilnosti proteinaze K, encimska aktivnost, aplikacije

The Proteina k Gre za encim, ki spada v skupino serinskih proteaz, to je, da ima v svojem aktivnem katalitičnem središču serinsko aminokislino in ima funkcijo loma peptidnih vezi s hidrolizo. Ta encim pripada družini subtilizinskih beljakovin (peptidaza S8).

K proteinaza ima molekulsko maso (PM) 28.900 daltonov in je bil prvič izoliran v 1.974 v izvlečkih gliv Engyodontium album, prej znano kot ime Tritirachium album Limber.

Molekularna struktura K proteinaze. Vir: Lykchiniadis [cc by-sa 4.0 (https: // creativeCommons.Org/licence/by-sa/4.0)]

Predstavlja visoko proteolitično sposobnost, ki jo dokazuje tako, da lahko razgradi keratin, ki je prisoten v laseh. Beseda Keratin v angleščini je napisana "Keratin", od tod prihaja, da se imenuje "Proteinsa K".

Ta encim je zaradi svoje velike moči za razcepitev domačih beljakovin uporaben v različnih tehnikah molekularne biologije. V glavnem se uporablja za izolacijo in pripravo nukleinskih kislin z visoko molekulsko maso (PM).

K proteinaza K deluje tako, da sprošča jedrsko DNK, hkrati pa uničuje beljakovine in neaktivne na RNAze in DNate, torej odpravlja jedra v pripravkih DNK in RNA.

Po drugi strani je bilo razvidno, da lahko K ​​proteinaza hidrolizira nekatere denaturirane domače beljakovine, zaradi česar je raziskovalce zanimalo za uporabo pri preučevanju prionskih beljakovin (PRPC).

Vendar pa kljub visoki proteolitični moči obstajajo beljakovine, ki so odporni na delovanje K proteina. Med njimi je nekaj anomalijskih beljakovin, imenovanih prions (PRPSC), povezanih s prenosljivimi spongiformnimi encefalopatijami.

[TOC]

Značilnosti proteinaze K

K proteinaza ima terciarno strukturo, sestavljeno iz treh slojev, z β listom sedmih medicinskih verig med dvema plastma propelerjev. Za pripadnost družini peptidaz S8 je značilno, da predstavlja katalitično triado na svojem aktivnem mestu, katere zaporedni vrstni red je (ASP, njegovo in bitje), ki jih razlikuje od drugih družin peptidaze.

Lahko vam služi: beljakovinske aminokisline

Za ta encim serinske proteazne skupine so značilne hidrolizirajoče peptidne vezi blizu karboksilne skupine alifatskih in aromatičnih aminokislin.

Po drugi strani pa lahko deluje v prisotnosti nekaterih korozivnih snovi, kot so natrijev dodecilsulfat (SDS), Tris-HCL in EDTA, ki se uporabljajo za pomoč denaturaciji beljakovin, zaradi česar izgubijo svojo domačo strukturo.

To je prejšnji korak pri pripravi beljakovin za tehniko elektroforeze. Domet pH, na katerega deluje K proteinsa, je precej širok (2.0 do 12.0), z optimalnim pH med 7.5 do 12.0, in njegova izoelektrična točka je 8.9. Kot je razvidno, je aktiven proti zelo širokem razponu pH.

Druga značilnost, ki izstopa v proteinazi K, je njegova stabilnost v prisotnosti visokih temperatur (50 - 60 ° C).

Encimska aktivnost

K proteinsa potrebuje prisotnost kalcijevega iona, čeprav ne vpliva na njegovo aktivnost, če je bistvenega pomena za ohranitev njegove stabilnosti.

Za K proteinsa je za izvedbo popolne prebave podlage potreben približni čas stika med 5 minutami do 2 uri.

Vendar pa so v tem smislu Daza in sodelavci primerjali čistost DNK, pridobljene v več izpostavljenosti proti K proteinazi, in ugotovili, da dolgotrajna inkubacija (do 24 ur) bistveno izboljša kakovost DNK.

Zdaj, glede na koncentracijo encima K proteinaze v različnih protokolih.

Uporablja se lahko od zelo nizkih koncentracij (5 µg/ml) do 500 µg/ml koncentracije. Toda najpogostejše delovne koncentracije segajo med 50-100 μg /ml, zlasti za prebavo beljakovin in nukleas. Čeprav je za zdravljenje tkiv potrebna koncentracija 2 mg/ml.

Vam lahko služi: easmotherium sibiricum: značilnosti, habitat, fosili

Prijave

Njihove aplikacije so zelo široke in jih je mogoče povzeti v naslednjem:

-Uporablja se pri prebavi beljakovin in ekstrakciji DNK z več metodami, kot so: solting-out, PK-SDS, cetil-tritil amonij (CTAB), spremenjeni kalijev acetat in natrijev ekstrakcijski acetat.

-Inaktivacija nukleas (RNASAS in DNASA).

-V tehniki hibridizacije In situ (Njegov), za pomoč pri sproščanju nukleinske kisline, poleg tega, da odpravimo neželene beljakovine.

-Sprememba beljakovin.

-Na ravni raziskav v različnih študijah.

Prednosti K proteinaze

Med tehnikami ekstrakcije DNK, ki uporabljajo K proteinazo, so bile izvedene različne primerjalne študije, pri čemer pa tudi drugi, ki je ne uporabljajo, in vse sklepajo, da obstajajo večje koristi, ko se encim uporablja. Med prednosti je mogoče omeniti naslednje:

-Dobimo visoko molekularno, visoko kakovostno in čistost DNK.

-Izvlečena DNK je stabilna do 3 mesece.

DNK, ekstrahirano, lahko uporabimo v naslednjih tehnikah: Southern blot, verižna reakcija polimeraze (PCR), elektroforeza, med drugim.

Proteine, odporne na beljakovine

Različne preiskave so ugotovile, da se prioni (strupeni PRPSC anomalični proteini razlikujejo od PRPC (domačih) beljakovin, saj so odporne na delovanje K proteinaze, medtem ko so PRP -ji občutljivi na njihovo delovanje.

Drugi avtorji so opisali, da v strukturi PRPSC obstajajo občutljivi deli in drugi odporni na K proteinazo K. Vendar sta obe strani enako strupeni in nalezljivi.

Po drugi strani so Bastian in sodelavci leta 1987 izolirali 4 beljakovine z 28, 30, 66 in 76 kDa od neke vrste Spiroplasma Mirum. Izkazalo se je, da je odporno na delovanje K proteinaze in je imelo tudi navzkrižno reakcijo z nekaterimi prioni.

Vam lahko služi: kemotoksis

Znano je, da lahko ta vrsta povzroči pomembne katarakte in nevrološke škode, zaradi znanstvenih ugotovitev Bastiana.

Vendar pa etiologija te degenerativne nevrološke patologije še vedno pripisuje Prionom.

V tem smislu so Butler in sodelavci leta 1991 identificirali in označili razred 40 kDa KDA -proteinaze -Rezistent iz dveh sevov iz dveh sevov Mycoplasma Hyorhinis. Ta patogen prizadene prašiče in okuži njihova tkiva, vendar v tem primeru ni bilo navzkrižne reakcije s testiranimi zapori.

Za razjasnitev številnih neznank je potrebnih več raziskav.

Reference

1. Bastian F, Jennings R in Gardner W. 1987. Antiserum za scrapijeve fibrilne beljakovine, ki so bili aktivirani Spiroplasma Mirum Fibril proteini. J. Klinika. Mikrobiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, King J, Ruiz V. Vrednotenje metode ekstrakcije in čiščenja DNK iz mišičnega tkiva, pritrjenega v formaldehidu neznanih trupel.  Med, 2014; 22 (1): 42–49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E in McGarrity G. Identifikacija in karakterizacija beljakovinskih K-odpornih beljakovin v članih razreda Mollicutes.  Okužba in imunost, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Marocoima A, Herrera L in drugi. Primerjava dveh protokolov ekstrakcije DNK Trypanosoma cruzi gojen v aksihenskem mediju. Rev. Peru. Med. Exp. Javno zdravje  2014; 31 (2): 222-227. Na voljo na: Scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E in Palma W. Določitev učinkovitosti petih protokolov ekstrakcije DNK iz parafiniranega materiala za molekularne študije. Rev Méd Medic Costarica. 2007; 1 (1): 10-19.