Tehnična rekombinantna DNK, aplikacije in osnove

On Rekombinantna DNK (DNK ali rDNA) je umetna molekula nukleinske kisline, ustvarjena v laboratoriju, z vključevanjem dveh segmentov organizma, ki vas zanimajo. Zahvaljujoč hibridni lastnosti je znan tudi kot himerna DNK. V naravi ne najdemo te vrste DNK.

Osnovna metodologija za njegovo ustvarjanje vključuje: (a) izbiro bele DNK in njegovo vstavljanje v drug fragment DNK (na splošno bakterijski plazmid); (b) Uvedba tega plazmida v bakterijo, (c) izbira bakterij skozi antibiotike in končno (d) ekspresija gena.

Vir: Pixabay.com

Tehnika izkorišča encimsko igro, ki omogoča kopiranje in lepljenje določenih fragmentov DNK v preizkus raziskovalca.

Cilj rekombinantne tehnologije je v večini primerov ekspresija proteina (znanega kot rekombinantni protein), ki si ga molekularni biolog zažele za prihodnje preiskave ali za ustvarjanje beljakovin komercialne in terapevtske vrednosti - na primer človeški insulin.

[TOC]

Osnove rekombinantne tehnike DNK in njegove uporabe v genetskem inženiringu

Osrednja dogma molekularne biologije

Vsa ekološka bitja, ki jih poznamo, imajo več značilnosti. Ena izmed njih je narava genetskega materiala in način proizvodnje beljakovin - proces, znan kot osrednja "dogma" molekularne biologije.

Z izjemo para virusov vsi organizmi hranijo genetske informacije v DNK (deoksiribonukleinska kislina), zbrani zelo kompaktni in organizirani v celičnem jedru.

Za gensko ekspresijo se molekula DNA prepisuje na messenger RNA, slednja pa se prevede v aminokislinski jezik, strukturni bloki beljakovin.

Kaj je rekombinantna DNK?

Med 70. in 80. let so molekularni biologi začeli izkoriščati procese, ki se naravno pojavljajo znotraj celice, in jih uspeli ekstrapolirati v laboratorij.

Na ta način bi lahko živalski gen (na primer vretenčarja) vstavili v segment DNK iz bakterij; ali DNK bakterije bi lahko kombinirali z virusno DNK. Tako lahko določimo rekombinantno DNK kot molekulo, sestavljeno iz DNK iz dveh različnih organizmov.

Ko je ta hibridna ali rekombinantna molekula ustvarjena, nadaljujemo z izražanjem gena za interes. Z besedo izraz Se želimo sklicevati na postopek prevajanja beljakovin.

Vam lahko služi: monohíbrid

Encimi za omejitve in lige: ključ do postopka

Ključni element za razvoj rekombinantne tehnologije DNK je bilo odkritje restrikcijskih encimov.

To so beljakovinske molekule, ki kažejo sposobnost razdelitve na DNK (nukleas) v betonskih zaporedjih, ki služijo kot "molekularne škarje". Fragmenti, ki jih ustvarijo ti encimi, se imenujejo restrikcijski fragmenti.

Ti encimi lahko ustvarijo v simetričnih rezih belega zaporedja (v obeh verigah na isti višini) ali asimetričnih rezih. Ključni vidik delovanja restrikcijskih encimov je, da po delitvi verig dobimo "ohlapen rob".

Nekaj ​​primerov sta ECOR 1 in SMA 1. Trenutno je znanih več kot 200 vrst restrikcijskih encimov in so komercialno na voljo.

Če želite biti koristne, mora škarje spremljati lepilo. To tesnjenje DNK (prej obdelano z restrikcijskimi encimi) izvajajo lige.

Tehnika: kako je DNK organizma v laboratoriju umetno spremenjen?

Nato bomo opisali glavne korake, ki jih zahteva rekombinantna tehnologija DNK. Vse izvajajo strokovnjaki v laboratoriju za molekularno biologijo.

Kaj je "klon"?

Preden nadaljujemo z eksperimentalnim protokolom, moramo opaziti, da se v molekularni biologiji in biotehnologiji izraz "klon" in glagol "klonar" široko uporabljata. To bi lahko privedlo do zmede.

V tem kontekstu se ne nanašamo na kloniranje vse organizem (kot na primer v primeru znanih ovac Dolly), vendar k kloniranju fragmenta DNK, ki je lahko gen. To pomeni, da ustvarijo številne kopije - gensko enake - zaporedja.

1. Izolacija in pridobivanje DNK

Prvi korak je odločitev, katero zaporedje želi uporabiti. To je popolnoma odvisno od raziskovalca in ciljev njegovega dela. Nato je treba ta DNK izolirati in očistiti. Metode in postopki za dosego tega so odvisni od organizma in tkiva.

Del tkiva se na splošno vzame in se zdravi v lizi. Nato se razdrobljenost genetskega materiala v majhnih fragmentih.

2. Kloniranje vektorja

Po pripravljalnih korakih si raziskovalec želi uvesti DNK, ki ga zanima vektor kloniranja. Od zdaj naprej do tega segmenta DNK ga bomo poimenovali beli DNK.

Lahko vam služi: prevladujoči gen: genetska načela, metode preučevanja, dejavniki

Plazmidi

Eden najbolj uporabljenih vektorjev v plazmidu bakterijskega izvora. Plazmid je molekula krožne DNK z dvojno verigo, ki jo najdemo naravno v bakterijah. So entitete zunaj bakterijskega kromosoma - to je zunajkromosomsko in jih seveda najdemo v teh prokariotih.

Osnovni elementi vektorja so: (a) izvor podvajanja, ki omogoča sintezo DNK; (b) izbirno sredstvo, ki omogoča identifikacijo organizmov, ki prenašajo plazmid z belo DNK, kot je odpornost proti antibiotiku; in (c) mesto z večkratništvom, kjer najdemo zaporedja, ki jih bodo prepoznali restrikcijski encimi.

Prvi uspešen rekombinantni DNK v laboratoriju je bil kloniran v plazmidu PSC101 iz bakterij In. coli. To vsebuje restrikcijsko mesto za restrikcijski encim Ecori in odpornost na antibiotik, poleg izvora podvajanja.

Vstavljanje bele DNK v plazmid izvede z molekularnim orodjem restrikcijskih encimov in lig, opisanih v prejšnjem razdelku.

Predstavne vrste vektorjev

Poleg plazmidov lahko DNK vstavite v drug vektor, kot je lambda bakteriofag.

3. Uvedba rekombinantne DNK

Ko je pridobljena rekombinantna molekula DNK (gen, ki ga zanima plazmid ali drug vektor).

Za uvedbo tuje DNK v bakteriji se uporablja tehnika, imenovana bakterijska transformacija, kjer se telo predloži zdravljenju z dvovalentnimi kationi, zaradi česar je dovzetna za jemanje DNK.

Metodološko ne moremo zagotoviti, da je 100% bakterij v našem pridelku učinkovito vzelo našo rekombinantno molekulo DNK. Tu se začne igrati del plazmida, ki vsebuje odpornost na antibiotike.

Tako bodo bakterije, ki so vzele plazmid, odporne na določen antibiotik. Če jih želite izbrati, bo dovolj za uporabo omenjenega antibiotika in vzeti preživele.

4. "Žetev" beljakovine

Po izbiri bakterij z našo rekombinantno DNK nadaljujemo z uporabo gostiteljskih encimskih strojev za ustvarjanje beljakovinskega produkta, ki vas zanima. Ko se bakterije reproducirajo, plazmid prehaja na svoje potomce, zato se med delitvijo ne izgubi.

Ta postopek uporablja bakterije kot nekakšno "tovarno" beljakovin. Kasneje bomo videli, da je bil zelo pomemben postopek pri razvoju učinkovitega zdravljenja.

Vam lahko služi: Telofase: Kaj je v mitozi v mejozi

Ko je pridelek pripravljen in bakterije proizvajajo velike količine beljakovin, je celica ali razpad celice. Obstaja široka paleta biokemijskih tehnik, ki omogočajo čiščenje beljakovin glede na njihove fizikalno-kemijske značilnosti.

V drugem eksperimentalnem kontekstu nas morda ne zanima ustvarjanje beljakovin, vendar nas zanima pridobivanje zaporedja DNK po sebi. Če bi bilo tako, bi plazmid služil za ustvarjanje več kopij fragmenta, ki nas zanimajo z namenom, da bi imeli zadostno količino bele DNK za izvedbo ustreznih poskusov.

Prijave

Rekombinantna tehnologija DNK je odprla neskončno število možnosti za molekularno biologijo, biotehnologijo, medicino in druga povezana območja. Vaše najbolj izjemne aplikacije so naslednje.

Genetska analiza

Prva aplikacija je neposredno povezana z molekularnimi laboratoriji za biologijo. Rekombinantna tehnologija DNK omogoča raziskovalcem, da razumejo normalno delovanje genov, pri nadaljnjih raziskavah pa se lahko uporabijo ustvarjene beljakovine.

Farmacevtska industrija

Beljakovine, proizvedene s postopkom rekombinantnega DNK, imajo uporabo v medicini. Dva zelo pomembna primera na terenu sta človeški insulin in rastni hormon, ki se uporablja pri bolnikih, ki nimajo takšnih beljakovin.

Zahvaljujoč rekombinantni DNK je te beljakovine mogoče ustvariti brez potrebe po izvlečenju iz drugega človeka, kar predstavlja dodatne metodološke zaplete in tveganja za zdravje. To je pripomoglo k izboljšanju kakovosti življenja neštetih bolnikov.

Reference

1. Baca, l. In. L., & Álvarez, c. L. C. (2015). Biologija 2. Uredniška skupina Patria.
2. Cooper, g. M., Hausman, r. In., & Hausman, r. In. (2000). Celica: molekularna pristop (Vol. 10). Washington, DC: ASM Press.
3. Devlin, t. M. (2004). Biokemija: učbenik s kliničnimi aplikacijami. Sem se obrnil.
4. Khan, s., Ullah, m. W., Siddique, r., Nabi, g., Manan, s., Yousaf, m., & Hou, h. (2016). Vloga rekombinantne tehnologije DNK za izboljšanje življenja. International Journal of Genomics, 2016, 2405954.
5. Mindan, f. Str., & Mindan, str. (devetnajst devetdeset šest). Patološka anatomija. Elsevier Španija.
6. Tortora, g. J., Funke, b. R., & Case, c. L. (2007). Uvod v mikrobiologijo. Ed. Pan -american Medical.
7. Njim. J. (1989). Človeški insulin: prvo zdravilo DNK tehnologije. American Journal of Health-Sistem Pharmacy, 46(11_suppl), S9-S11.